技术领域
本发明涉及的是一种干海参线粒体的提取与纯化技术。
背景技术
海参属于棘皮动物门。海参不仅是海产之美味佳肴，而且是名贵的滋补中药材。在《本草纲目》、《中国药用动物志》等药学著作上均有记载。临床用于肾虚阳萎、便秘、贫血、胃溃疡、糖尿病、肿瘤等疾病的防治。近年来，海参的开发研究日益受到重视。从组织细胞中成功地提取DNA,是进行一切有关分子遗传学和分子生物学研究的前提。虽然文献中已所道了许多动植物DNA提取的方法。但是研究中我们仍需要根据材料的不同情况进行DNA提取方法的改进及筛选比较。最近，我们在对干海参进行分子标志的研究时发现，由于干海参已被加工处理过，且富含多肽、海参酸性粘多糖、海参忒、硫酸软骨素、胶原蛋白等多种物质。使得DNA埋在这种黏稠胶状物通过反复试验，我们探索出一种迅速、简便、经济的分离纯化干海参线粒体的方法,应用该法可有效去除干海参中的各种杂质，得到高纯度、高得率的总DNAO可进行PCR扩增，为干海参的进一步研究奠定技术基础。
发明内容：
本发明的目的是提供一种干海参线粒体的提取与纯化技术。
本发明的目的是这样实现的：取实验材料为仿刺参和大西洋海参的干参制品，以少煮多泡的原则浸发开，立即使用或置于-80°C超低温冰箱保存备用；线粒体提取纯化方法：
（1）称取0.3g海参体壁，冲洗干净，用无菌纸吸干,切碎或置液氮研碎；
（2）将样品放于印r的蛋白酶水解液中；
（3）样品迅速置于65°C水溶2h以上，若溶解不完全,则可过夜处理，直至样品完全溶解；
（4）冷却至室温后，加入等体积的氯仿一异戊醇轻柔颠倒；
（5）室温r/min,离心10min,收集上清液；
（6）重复以上两个步骤几次，至有机相和水相之间无变性蛋白质；
（7）取上清液加入等体积的沉淀缓冲液，保温于65°C,30min；
（8）以氯仿一异戊醇抽提几次，至有机相和水相之间无杂质；
（9）收集上清液,加等体积的异丙醇轻柔颠倒,r/min。可得到白色沉淀；
（10）沉淀用70%的乙醇清洗两次，空气干燥后，用lOOWTE缓冲液溶解,4°C保存备用。
具体实施方式
取实验材料为仿刺参和大西洋海参的干参制品，以少煮多泡的原则浸发开，立即使用或置于-80°C超低温冰箱保存备用，线粒体提取纯化方法；
（1）称取0.3g海参体壁，冲洗干净,用无菌纸吸干，切碎或置液氮研碎；
（2）将样品放于卩lr的蛋白酶水解液中；
（3）样品迅速置于65°C水溶2h以上，若溶解不完全,则可过夜处理，直至样品完全溶解；
（4）冷却至室温后，加入等体积的氯仿一异戊醇轻柔颠倒；
（5）室温r/min,离心lOmin,收集上清液；
（6）重复以上两个步骤几次,至有机相和水相之间无变性蛋白质；
（7）取上清液加入等体积的沉淀缓冲液，保温于65°C,30min；
（8）以氯仿一异戊醇抽提几次,至有机相和水相之间无杂质；
（9）收集上清液，加等体积的异丙醇轻柔颠倒，r/mino可得到白色沉淀；
（10）沉淀用70%的乙醇清洗两次，空气干燥后，用印TE缓冲液溶解,4°C保存备用。
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